Pintor, muralista e escultor, o “equatoriano universal cuja obra transcende todas as fronteiras…”, nas palavras de Pablo Neruda, era filho de um índio e de uma mestiça. Estudou na Escola de Belas-Artes de Quito entre 1932 e 1940. Em 1939, participou de uma exposição coletiva no Sindicato dos Escritores e Artistas do Equador. Sua primeira exposição individual foi realizada em 1942. Nos anos 1940, teve diversas obras compradas por Nelson Rockefeller, o que o levou aos Estados Unidos, onde expôs, em 1943, no Museum of Art (Três pintores sul-americanos em São Francisco) e no City Art Museum, Saint Louis (Artistas sul-americanos), com Susana Guevara, Enrique G. Brent e Candido Portinari. Ainda nesse ano, no México, estudou com José Clemente Orozco (1883-1949) a pintura em afresco.
Entre 1944 e 1945, Guayasamín viajou pela América do Sul, visitando o Peru, a Bolívia, a Argentina, o Uruguai e o Brasil. Além de expor nesses países, compôs uma série de quadros impactantes chamados Huacayñán, o “caminho das lágrimas” em língua quíchua, que foram apresentados no Museu de Arte Colonial, em Quito, em 1951, e no Museu de Belas-Artes de Caracas, em 1952 (e depois em diversas cidades do mundo). Em 1948, criou seu primeiro afresco, El incario y la conquista, para a Casa de Cultura do Equador. Em 1956, recebeu o Grande Prêmio da III Bienal Hispano-Americana Espanha de Arte, em Barcelona, e no ano seguinte o Grande Prêmio de Pintura na IV Bienal de São Paulo (que voltou a exibir suas telas na XX edição).
Nos anos 1950, expôs diversas vezes nos Estados Unidos, na Europa e em vários países da América Latina. Em 1960, recebeu uma sala de honra na II Bienal Interamericana de Pintura, Escultura e Gravura do México, onde também foi premiado. Nos anos 1960, criou uma série de 250 telas denominadas La edad de la ira, que foram exibidas em 1966 na Galeria Dois Mundos, em Roma, no Museu de Belas-Artes do México, em 1968, e no Museu de Belas-Arte de Santiago, Chile, em 1969, antes de seguir pelo resto do mundo. Em 1974, Guayasamín recebeu o título de “Officier de L’Ordre des Arts et des Lettres” do governo da França, que lhe concedeu também a Legião de Honra, em 1984.
Nos anos 1970, várias retrospectivas de sua obra tiveram lugar em São Francisco, 1974, Medellín (Colômbia), 1976, Quito, 1977, São Petersburgo (Museu L’Hermitage) e Havana (Museu Nacional), ambas em 1982. Em 1994, recebeu medalha da Unesco pela Defesa dos Direitos Humanos. Suas últimas exposições foram realizadas em 1995, no Museu do Palácio de Luxemburgo, em Paris, e no Museu Palais de Glace, em Buenos Aires.
Pouco antes de seu falecimento, o artista trabalhava em uma obra chamada La capilla del hombre. Deixou diversos murais em várias cidades, como Quito (nos Palácios de Governo e no Legislativo, na Universidade Central e no Conselho Provincial), Madri (Aeroporto de Barajas), Paris (na sede da Unesco) e São Paulo (Madre y niño, no Parlamento Latino-Americano, no Memorial da América Latina, edifício projetado por Oscar Niemeyer). Entre seus monumentos se destacam A la patria joven em Guayaquil (Equador) e A la resistencia (Rumiñahui), em Quito. Deixou também vários retratos de políticos e intelectuais, como Fidel Castro e Raúl Castro, François e Danielle Mitterrand, Gabriel García Márquez, Rigoberta Menchú e do presidente brasileiro Juscelino Kubitschek. Em 2001, a Casa da Cultura Equatoriana inaugurou a mostra Homenagem ao Mestre Oswaldo Guayasamín.