Descendente de judeus imigrantes, César Milstein graduou-se em química, em 1952, pela Universidade de Buenos Aires (UBA) e, em 1957, doutorou-se pela mesma universidade. Em 1957, foi aprovado em concurso para trabalhar como pesquisador no Instituto Nacional de Microbiologia Carlos Malbrán. Posteriormente, estudaria em Cambridge, beneficiado por uma bolsa, para trabalhar no Medical Centre Research. Em 1960, recebeu o título de Philosophy Doctor (PhD) por essa universidade.
De volta à Argentina em 1961, chefiou o recém-criado Departamento de Biologia Molecular do Instituto Malbrán. Seu trabalho foi dificultado pelo golpe militar de 1962, pois o Instituto sofreu intervenção. Diante dessas dificuldades, Milstein retornou ao Medical Centre Research em 1964, onde se dedicou integralmente à pesquisa.
Em 1983, adotou a cidadania inglesa e foi nomeado chefe e diretor da Divisão de Química de Proteínas e Ácidos Nucleicos da Universidade de Cambridge.
No ano seguinte, recebeu o Prêmio Nobel de Medicina e Farmacologia, juntamente com Niels K. Jerne e Georges J. F. Köhler, pelas suas descobertas relacionadas às especificidades do desenvolvimento e controle do sistema imunológico e pela descoberta de uma técnica para produzir anticorpos monoclonais em grande escala.
Faleceu aos 75 anos, em decorrência de problemas cardíacos.