Pintor, muralista y artista gráfico, descendiente de indios zapotecas, Tamayo quedó huérfano a los ocho años de edad. A los doce se mudó a la ciudad de México, donde estudió en la Academia San Carlos (1917), mientras vendía frutas en el mercado de la ciudad. En ese período conoció a Roberto Montenegro y comenzó a militar por el nacionalismo cultural. En 1921 fue nombrado jefe del Departamento de Dibujo Etnográfico del Museo Nacional de Arqueología, que desde la Revolución Mexicana de 1910 se dedicaba a clasificar el legado precolonial. Ese trabajo influenció fuertemente su obra, marcada por la integración de las formas precolombinas con las conquistas del modernismo (del cubismo a la abstracción).
En 1921 también estuvo en Nueva York, realizando su primera exposición en la Weyhe Gallery, a la que le siguió otra en la Ciudad de México, en 1926. Entre 1928 y 1930 enseñó en la Academia Nacional de Bellas Artes y en la Academia San Carlos (en esa época, dirigida por Diego Rivera), y en 1932 estuvo al frente del Departamento de Artes Plásticas de la Secretaría de Educación Pública. Al año siguiente produjo los frescos para el Conservatorio de Música de la Ciudad de México, con temas que exaltaban tanto la naturaleza mexicana como a los trabajadores de la Revolución. En 1936 participó, con José Clemente Orozco (1883-1949) y David Alfaro Siqueiros, de la delegación mexicana en el Congreso de los Artistas y, en 1938, creó el mural de carácter social La revolución (en el Museo Nacional de Antropología).
Entre 1939 y 1949 residió en Nueva York y enseñó en la Dalton School. En ese período expuso varias veces en los Estados Unidos y en México. En 1948 se efectuó una amplia retrospectiva de su obra en el Palacio de Bellas Artes, en la Ciudad de México, lugar en que el artista también concretó, en 1952, un gran y significativo mural denominado México hoy. En 1950, la Bienal de Venecia (a la cual retornó en 1968) le concedió una sala especial. En 1952 fue premiado en el Carnegie International y en 1955 recibió el Gran Premio de Pintura en la II Bienal de São Paulo (a la cual volvió en 1993, en la XXII edición). Además, en 1955 concluyó el mural El hombre para el Museo de Bellas Artes de Dallas, y otro, en el Palacio de Bellas Artes, en el que abordaba el nacimiento de la nacionalidad mexicana.
En los años 50 pintó en caballete telas de formas abstractas y superficies marcadas por distintas texturas, como Bestia herida (1953) y El hombre del teléfono (1956), que forman parte de los principales museos del mundo. En 1956 recibió la condecoración de Chevalier de la Légion d’Honneur del gobierno francés, el mismo año en que creó el mural América, para un banco en la ciudad de Houston, en los Estados Unidos, tal vez su obra de mayor envergadura. Al año siguiente se mudó a París. En 1958 realizó el mural Prometeo para la Sala de Conferencias del edificio de la Unesco, en París, y conquistó el Premio Internacional Guggenheim. En 1959 participó de Documenta II. En 1961 fue elegido miembro de la Academia Americana de Artes y Letras, antes de su retorno a México en 1964.
En las pantallas de cine recibió homenaje en la película Tamayo (1970) de Max Pol, y en La vida artística de Rufino Tamayo (1973) de H. Cokin. En 1974, el pintor mexicano donó a su ciudad natal una colección de casi 1.300 piezas de arte precolombino, actualmente expuestas en el Museo de Arte Prehispánico Rufino Tamayo. En 1981 se creó en la Ciudad de México el Museo Rufino Tamayo de Arte Contemporáneo, que alberga su colección de arte contemporáneo y obras de más de 150 artistas. De 1981 a 1982 fue director de la Escuela de Bellas Artes de la Universidad Autónoma Benito Juárez de Oaxaca. En 1987, una exposición con más de setecientas de sus pinturas fue presentada en la Ciudad de México, en el Palacio de Bellas Artes y en el Museo Tamayo.