Descendiente de judíos inmigrantes, César Milstein se graduó en química en la Universidad de Buenos Aires (UBA) en 1952 y en 1957 se doctoró en la misma universidad. En 1957 aprobó el concurso para trabajar como investigador en el Instituto Nacional de Microbiología Carlos Malbrán. Luego estudió en Cambridge, al ser beneficiado por una beca para trabajar en el Medical Centre Research. En 1960 recibió el título de Philosophy Doctor (PhD) de esa universidad.
De regreso a la Argentina, en 1961, dirigió el recién creado Departamento de Biología Molecular del Instituto Malbrán. Su trabajo se vio obstaculizado por el golpe militar de 1962, pues el Instituto sufrió una intervención. Frente a esas dificultades, Milstein retornó al Medical Centre Research en 1964, donde se dedicó completamente a la investigación.
En 1983 adoptó la ciudadanía inglesa y fue nombrado jefe y director de la División de Química de Proteínas y Ácidos Nucleicos de la Universidad de Cambridge.
Al año siguiente recibió el Premio Nobel de Medicina y Farmacología, junto a Niels K. Jerne y Georges J. F. Köhler, tanto por sus descubrimientos relacionados con las especificidades del desarrollo y control del sistema inmunológico como por el descubrimiento de una técnica para producir anticuerpos monoclonales a gran escala.
Falleció a los 75 años, como consecuencia de problemas cardíacos.