Pintor, muralista e artista gráfico, descendente de índios zapotecas, Tamayo ficou órfão aos oito anos de idade. Aos doze, mudou-se para a Cidade do México, onde estudou na Academia San Carlos (1917), enquanto vendia frutas no mercado da cidade. Nesse período conheceu Roberto Montenegro e começou a militar pelo nacionalismo cultural. Em 1921, passou a chefiar o Departamento de Desenho Etnográfico do Museu Nacional de Arqueologia, que desde a Revolução Mexicana de 1910 se dedicava a classificar o legado pré-colonial. Esse trabalho influenciou fortemente sua obra, marcada pela integração das formas pré-colombianas com as conquistas do modernismo (do cubismo à abstração).
Ainda em 1921, esteve em Nova York, realizando sua primeira exposição na Weyhe Gallery, seguida de outra na Cidade do México, em 1926. Entre 1928 e 1930, lecionou na Academia Nacional de Belas-Artes e na Academia San Carlos (na época, dirigida por Diego Rivera) e, em 1932, esteve à frente do Departamento de Artes Plásticas da Secretaria de Educação Pública. No ano seguinte, produziu os afrescos para o Conservatório de Música da Cidade do México, com temas em que exaltava tanto a natureza mexicana quanto os trabalhadores da Revolução. Em 1936, participou, com José Clemente Orozco (1883-1949) e David Alfaro Siqueiros, da delegação mexicana no Congresso dos Artistas e, em 1938, criou o mural de caráter social La revolución (no Museu Nacional de Antropologia).
Entre 1939 e 1949, residiu em Nova York e lecionou na Escola Dalton. Nesse período expôs diversas vezes nos EUA e no México. Em 1948, uma ampla retrospectiva de sua obra foi apresentada no Palácio de Belas-Artes, na Cidade do México, local em que o artista também concretizou, em 1952, um grande e marcante mural denominado México hoy. Em 1950, a Bienal de Veneza (à qual retornou em 1968) concedeu-lhe uma sala especial. Foi premiado no Carnegie International em 1952 e, em 1955, recebeu o Grande Prêmio de Pintura na II Bienal de São Paulo (à qual retornou em 1993, na XXII edição). Ainda em 1955, concluiu o mural El hombre, para o Museu de Belas-Artes de Dallas, e outro, no Palácio de Belas-Artes, tratando do nascimento da nacionalidade mexicana.
Nos anos 50, pintou em cavalete telas de formas abstratas e superfícies marcadas por distintas texturas, como Bestia herida (1953) e El hombre del teléfono (1956), que constam nos principais museus do mundo. Em 1956, recebeu a condecoração de Chevalier de la Légion d’Honneur do governo francês, mesmo ano em que criou o mural América, para um banco na cidade de Houston, nos Estados Unidos, talvez sua obra de maior envergadura. No ano seguinte, mudou-se para Paris. Em 1958, realizou o mural Prometeo para a Sala de Conferências do edifício da Unesco, em Paris e conquistou o Prêmio Internacional da Guggenheim. Em 1959, participou da Documenta II. Em 1961, foi eleito membro da Academia Americana de Artes e Letras, antes de seu retorno ao México, em 1964.
Nas telas de cinema foi homenageado no filme Tamayo (1970), de Max Pol, e em La vida artística de Rufino Tamayo (1973), de H. Cokin. Em 1974, o pintor mexicano doou à sua cidade natal uma coleção de cerca de 1.300 peças de arte pré-colombiana, atualmente expostas no Museo de Arte Prehispánico Rufino Tamayo. Em 1981, foi criado na Cidade do México o Museu Rufino Tamayo de Arte Contemporânea, que abriga sua coleção de arte contemporânea e obras de mais de 150 artistas. De 1981 a 1982, foi diretor da Escola de Belas-Artes da Universidade Autônoma Benito Juárez de Oaxaca. Em 1987, uma exposição com mais de setecentas de suas pinturas foi apresentada na Cidade do México, no Palácio de Belas-Artes e no Museu Tamayo.